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牛胰島素樣生長因子結合蛋白-1檢測試劑盒

使用說明書
本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
預期應用
ELISA 法定量測定牛血清、血漿或其它相關生物液體中胰島素樣生長因子結合蛋白-1含量。
實驗原理
用純化的胃泌素抗體包被微孔板,制成固相載體,往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的胃泌素抗體、HRP 標記的親和素,經過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胃泌素呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1、酶標板:一塊(96 孔)
2、標準品(凍干品): 2 瓶,請臨用前15 分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后室溫靜置大約10 分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為500 pg/ml,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成500 pg/ml,250 pg/ml,125pg/ml
62.5 pg/ml,31.2 pg/ml,15.6 pg/ml,7.8 pg/ml,樣品稀釋液直接作為空白孔0 pg/ml。
如配制250 pg/ml 標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml )500 pg/ml 的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf 管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3、樣品稀釋液:1×20ml。
4、檢測稀釋液A:1×10ml。
5、檢測稀釋液B:1×10ml。
6、檢測溶液A:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液A 1:100 稀釋(如:10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A),充分混勻,稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100 /孔),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。
7、檢測溶液B:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液B 1:100 稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8、底物溶液:1×10ml/瓶。
9、濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10、終止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
11、覆膜:5 張
12、使用說明書:1 份
自備物品
1、酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2、微量加液器及吸頭,EP 管
3、蒸餾水或去離子水,濾紙
牛胰島素樣生長因子結合蛋白-1檢測試劑盒標本的采集及保存
1、血清:全血標本請于室溫放置2 小時或4 過夜后于1000 g 離心20 分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20 或-80 保存,但應避免反復凍融。
2、血漿:可用EDTA 或肝素作為抗凝劑,標本采集后30 分鐘內于1000 g 離心15 分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20 或-80 保存,但應避免反復凍融。
3、其它生物標本:請1000 g 離心20 分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20 或-80 保存,但應避免反復凍融。
注:以上標本均應密封保存,4 保存應小于1 周,-20 不應超過1 個月,-80 不應超過2 個月;標本溶血會影響后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫,試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,如樣品濃度過高時,應對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1、加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00 ,余孔分別加標準品或待測樣品100 ,注意不要有氣泡,加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37 溫育2 小時。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A 工作液100 (臨用前配制),酶標板加上覆膜,37 溫育1 小時。
3、棄去孔內液體,甩干,洗板3 次,每次浸泡1-2 分鐘,大約400 /每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
4、每孔加檢測溶液B 工作液(臨用前配制)100 ,加上覆膜,37 溫育1 小時。
5、棄去孔內液體,甩干,洗板5 次,方法同步驟3。
6、每孔加底物溶液90 ,酶標板加上覆膜37 避光顯色(反應時間控制在15-30 分鐘,當標準孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍色,后3-4 孔梯度不明顯時,即可終止)。
7、每孔加終止溶液50 ,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。
8、立即用酶標儀在450nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)。
注:
1、試劑準備:所有試劑在使用前應平衡至室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
2、加樣:加樣或加試劑時,個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的“預溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)需控制在10 分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、溫育:為防止樣品蒸發,實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內,以避免液體蒸發;洗板后應盡快進行下步操作,任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響后的酶標儀讀數。
5、試劑配制:Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請依據所需的量配制使用,并使用相應的稀釋液配制,不能混淆。請配制標準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A 時,一次不要小于10 ),以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液。
6、反應時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如,每隔10 分鐘),如顏色較深,請提前加入終止液終止反應,避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7、底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。
洗板方法
1、手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml 注入孔內,浸泡1-2 分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;根據需要,重復此過程數次。
2、自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠胃泌素,且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
各標準品及樣本OD 值扣除空白孔OD 值后作圖(七點圖),如設置復孔,則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(對數坐標),OD 值為橫坐標(對數坐標),在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析,如curve expert 1.3,根據樣品OD 值,由標準曲線查出相應的濃度,乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。
檢測范圍: 7.8 pg/ml - 500 pg/ml,繪制標準曲線請取用以下濃度值:500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.2 pg/ml,15.6 pg/ml,7.8 pg/ml。低檢測限:3.9 pg/ml
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本/ 標準品,酶結合物或底物時,個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的“預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質,此為正?,F象,不會對實驗結果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期:6 個月

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